搖床T25細胞培養(yǎng)瓶流體力學與傳質特性研究

引 言

動物細胞培養(yǎng)是生物技術的一個重要分支，是現(xiàn)代生物醫(yī)藥的支柱?，F(xiàn)有的治療性生物制品超過50%在動物細胞中產生。2018年，基于動物細胞培養(yǎng)的診療產品產值約為2372億美元，預計2024年增長至3890億美元[1]。隨著細胞培養(yǎng)工藝的日漸成熟，近年來又有新的應用領域被開發(fā)出來，如細胞培養(yǎng)肉技術[2]。在這種背景下，越來越多的研究人員開始關注動物細胞培養(yǎng)相關研究。

實驗室規(guī)模的動物細胞培養(yǎng)常在孔板、方瓶和轉瓶中進行[3]。其中孔板和方瓶主要用于靜置培養(yǎng)，轉瓶主要用于懸浮培養(yǎng)。相對于靜置培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)可以達到更高的細胞密度，尤其是對于貼壁依賴型細胞，如常用的模式細胞HEK293[4]，某些CHO細胞系，以及牛[5]或者豬肌肉干細胞[6]等。這些細胞在孔板或方瓶中單層貼壁培養(yǎng)僅能達到104~105 cells/cm2，而懸浮培養(yǎng)則可以達到106~107 cells/ml或更高。在細胞培養(yǎng)放大過程中，方瓶還常常作為中間步驟用于轉瓶或小型攪拌釜反應器之前[4]。Zhang等[7]通過分析得出，實驗室常用的Thermo Fisher Scientific T25培養(yǎng)瓶的傳質系數(shù)比250 ml轉瓶高10倍左右，理論上可以支持更高的細胞濃度。如果可以在方瓶中進行懸浮培養(yǎng)，尤其是加有微載體的懸浮培養(yǎng)，進而達到更高的密度，對簡化細胞培養(yǎng)工藝、減少放大步驟將有很大的幫助。此外，得益于方瓶的微小體積（T25方瓶最大裝液量不超過10 ml），還可以實現(xiàn)高通量篩選，避免靜置培養(yǎng)時由于混合、傳質、剪切等條件與大型反應器不同，篩選到不適合大規(guī)模生產的細胞系或者培養(yǎng)基[8]。

Fujii等[9]研究了使用超聲波使細胞在T25培養(yǎng)瓶中懸浮的技術，發(fā)現(xiàn)在超聲波的作用下懸浮的CHO細胞增殖1000倍的時間比靜置培養(yǎng)縮短了14%。然而這種做法需要特殊的超聲波發(fā)生器，較難推廣。事實上，只要將方瓶置于翹板搖床（或稱“擺床”）之上，就有可能實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，其機理類似于思拓凡(Cytiva，原GE Healthcare)的波浪式（WAVE?）反應器。此類反應器出現(xiàn)在20世紀90年代，是最早的一次性生物反應器，如今已廣泛應用于從實驗室到中試規(guī)模的細胞培養(yǎng)[10-12]。Zhan等[13]通過計算流體力學(CFD)模擬研究了WAVE反應器內的流體力學特性，并發(fā)現(xiàn)了特定擺動頻率下由于共振現(xiàn)象使混合和傳質變差的現(xiàn)象。然而，由于方瓶特征尺寸較小，湍流程度較低，其操作條件與常規(guī)的臺式波浪反應器之間不能簡單換算，因此有必要針對T25培養(yǎng)瓶進行進一步研究。

本文將傳統(tǒng)上一般用于靜置培養(yǎng)的T25方形培養(yǎng)瓶置于翹板搖床上，對其傳質及混合特性進行了系統(tǒng)性研究，并借助CFD模型對不同操作條件下的能量耗散和剪切情況進行了分析。報道了不同振蕩頻率下T25方瓶的傳質系數(shù)、混合時間等基礎數(shù)據(jù)，為使用該裝置進行高密度細胞懸浮培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。這將有利于推動基于T25方瓶的一次性微型反應器開發(fā)，實現(xiàn)高通量篩選，促進生物醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

T25細胞培養(yǎng)瓶，購自Thermo Fisher Scientific公司，材質為聚苯乙烯，底面積為25 cm2，工作體積7 ml。實驗中所需的磷酸二氫鉀（99%）、氯化鈉（99.8%）、二水合磷酸二氫鈉（99%）和十二水合磷酸氫二鈉（99%），購自國藥集團化學試劑有限公司。溴百里香酚藍（生物技術級），購自上海麥克林生化科技有限公司。氮氣，購自無錫市鑫錫儀科技有限公司。實驗用水為超純水。稱取0.072 g磷酸二氫鉀，0.531 g十二水合磷酸氫二鈉和4.5 g氯化鈉于燒杯中，加少量水溶解，轉移到容量瓶中并定容至500 ml，配制得到PBS溶液。取5.3 ml的0.2 mol/L的二水合磷酸二氫鈉溶液與94.7 ml的0.2 mol/L的十二水合磷酸氫二鈉溶液混勻，取10 ml混合液加0.1 g溴百里香酚藍，配制得到示蹤劑溶液。

1.2 分析測試儀器

光學溶氧傳感器，SP-PSt3型，德國PreSens公司；翹板搖床，SLK-R3000-S型，美國SCILOGEX公司；Q-Flow轉子流量計（0~100 ml/min），瑞士vogtlin。

1.3 實驗裝置

T25細胞培養(yǎng)瓶冷模實驗裝置如圖1所示，它由翹板搖床、氮氣供給系統(tǒng)、空氣供給系統(tǒng)、光學溶氧傳感器、攝像頭以及T25培養(yǎng)瓶等部分組成。在傳質實驗中，首先通入氮氣以置換培養(yǎng)瓶中的溶解氧和氣相中的氧氣，之后切換為空氣，記錄液相中溶解氧的變化趨勢。在混合實驗中，通過攝像頭記錄示蹤劑的混合過程。

圖1

圖1   T25細胞培養(yǎng)瓶冷模實驗裝置

Fig.1   Cold-flow experimental setup for the rocking T25 flask micro-reactor system

1.4 實驗方法

1.4.1 傳質系數(shù)

反應器的傳質性能一般用體積氧傳質系數(shù)kLa表征，常用的冷模測量方法是亞硫酸鹽氧化法，通過亞硫酸鈉和氧發(fā)生反應消耗溶解氧進行計算。然而亞硫酸鈉溶液的性質與細胞反應體系相差較大，不能反映細胞培養(yǎng)時的真實情況。本實驗使用與細胞培養(yǎng)體系性質接近的PBS溶液和動態(tài)充氧法[14-16]。動態(tài)充氧法輔助設備少，操作簡單，對體系影響小，可以使用與實際細胞培養(yǎng)相同或相近的物系進行實驗，數(shù)據(jù)有更好的參考價值。缺點是用于T25培養(yǎng)瓶這類小型反應器時需要微型光學溶氧傳感器，成本較高。

本研究所用光學溶氧傳感器基于熒光淬滅作用，感應元件為直徑5 mm的玻璃貼片，粘貼于培養(yǎng)瓶內的底部，使用前根據(jù)制造商說明進行了校準。首先將氮氣通入T25培養(yǎng)瓶驅趕PBS中的溶解氧，當溶解氧濃度達到零或較低數(shù)值時，停止通氮氣并迅速切換為空氣，實時監(jiān)測并記錄溶氧濃度的變化，直至溶氧達到飽和。在液相理想混合、氣相氧氣濃度為常數(shù)時，根據(jù)式（1）求得體積氧傳質系數(shù)：

C*?CLC*?CL0=e?kLat$\frac{C^{*}-C_L}{C^{*}-C_{L0}}=e^{-k_{L}at}$(1)

其中，C* 為與氣相氧氣分壓對應的飽和溶氧濃度，mg/L,在動態(tài)充氧法中，需要將容器內氣相快速置換為空氣，才能確定C* 的值；CL0和CL分別為0時刻和t時刻實際測量的溶氧濃度，mg/L。由于光學溶氧傳感器的響應時間常數(shù)遠小于溶氧達到平衡的時間[7]，本實驗中忽略傳感器響應時間的影響。

1.4.2 混合時間

綜合考慮染料的溶解度和顏色強度，選擇溴百里香酚藍作為示蹤劑。在翹板搖床一定轉速下，使T25培養(yǎng)瓶達到流體力學擬穩(wěn)態(tài)，用一次性巴氏吸管滴加1滴溴百里香酚藍溶液，通過固定在翹板搖床上與培養(yǎng)瓶同步運動的攝像頭以60 幀/秒或120 幀/秒的幀率和640×480分辨率錄制混合過程的視頻。使用Python語言開發(fā)了基于OpenCV的計算機視覺算法對上述視頻進行處理。同時，使用了快速傅里葉變換（FFT）過濾掉由于翹板搖床振蕩引起的干擾。由于溴百里香酚藍對紅色光吸收最強烈，算法得到整個視野內所有像素紅色光強度的標準偏差隨時間變化的曲線。當標準偏差不再變化時，即認為混合均勻。本方法不依賴吸光度的絕對值，具有更高的靈敏度和分辨率。此處獲得的混合時間還用于后續(xù)計算流體力學模型驗證。

1.5 計算流體力學模型

1.5.1 幾何模型與網格劃分

CFD模型的建立和求解使用了Ansys 2020 R2中的Fluent。T25培養(yǎng)瓶底面積25 cm2，高3.0 cm，頸部具有一定角度。裝液量為10 ml時，液面高度為0.4 cm，之上為氣相。為了減少網格數(shù)量，提高計算速度，幾何模型只包含方瓶底部的1.5 cm部分。整個幾何模型采用六面體結構化網格進行劃分，如圖2所示。其中，靠近方瓶底部的液相區(qū)域進行了加密處理，以提高模型精度，捕捉更多細節(jié)。經網格無關性分析，確定最終網格和節(jié)點數(shù)量分別為344×103和362×103。

圖2

圖2   T25細胞培養(yǎng)瓶幾何模型及網格劃分

Fig.2   Geometry and meshing of the T25 flask used in the CFD model

1.5.2 數(shù)學模型

由于T25培養(yǎng)瓶中氣液兩相有明顯的分界面，CFD采用VOF多相流模型。在VOF模型中，不同流體組分共用同一套動量方程，僅計算各計算單元內的各流體組分體積分數(shù)。兩相之間的相互作用只有表面張力，此處設置為72 mN/m。搖瓶的運動通過編譯自定義函數(shù)(UDF)動態(tài)網格實現(xiàn)，其數(shù)學表達式為

ω=Acos (2πft)2πf$\omega =Acos\left(2\pi ft\right)2\pi f$(2)

其中，ω$\omega$為培養(yǎng)瓶繞旋轉軸的旋轉角速度，rad/s；A為振幅，rad，本研究使用的搖床A=0.03889 rad；f$f$為振蕩頻率，Hz；t為時間，s。運動原點位于距方瓶底部中心3 cm的位置，坐標為（0，0，-0.03）；旋轉軸為+Y$+Y$軸，重力加速度指向?Z$-Z$方向（圖2）。為確定合適的湍流模型，首先對T25培養(yǎng)瓶的雷諾數(shù)進行了分析。培養(yǎng)瓶內為明渠流（open-channel flow），特征長度選用水力半徑Rh，其定義式為[17]

Rh=whw+2h$R_h=\frac{wh}{w+2h}$(3)

其中，w為液面寬度，m；h為液層深度，m；分母w+2h$w+2h$為濕周長；相應地，其雷諾數(shù)可表示為

Re=ρωmaxrRhμ$Re=\frac{\rho {\omega }_{max}r{R}_h}{\mu }$(4)

其中，ωmax${\omega }_{max}$為搖床運動的最大角速度，rad/s；r為T25方瓶內液面與搖床轉軸之間的距離。根據(jù)式（4），搖床轉速為10~30 r/min時，Re<500，位于層流區(qū)，無須湍流模型。轉速為60~80 r/min時，Re>1000，選取SST k-ω湍流模型，該模型在較低雷諾數(shù)時也有良好的表現(xiàn)[18-19]。對于過渡區(qū)（40~50 r/min）的準確模擬較為困難，本文考察并比較了SST k-ω，Transition k-kl-ω和Transition SST模型。

在開始動態(tài)網格模擬之前，首先設置ω=0$\omega =0$，在靜止狀態(tài)下使表面張力作用達到平衡，然后啟用式（2），用動態(tài)網格求解。求解過程中監(jiān)視體系內平均液速隨時間的振蕩，直至達到擬穩(wěn)態(tài)。之后，開啟組分傳輸模型并加入示蹤劑繼續(xù)以動態(tài)網格求解。由于示蹤劑濃度極低，為了不影響體系性質，其理化性質假設與水完全相同，擴散系數(shù)采用水的自擴散系數(shù)2.9×10-9 m2/s。求解過程中監(jiān)視體系計算域內多點示蹤劑質量分數(shù)隨時間的變化，直至混合均勻。

剪切應力和能量耗散率是影響動物細胞培養(yǎng)的重要參數(shù)，但是直接測量微型反應器內的剪切應力和能量耗散率比較困難，而通過CFD模擬則比較容易獲得。剪切應力和總的能量耗散率的表達式分別為

τ=ρk+μS$\tau =\rho k+\mu S$(5)P=∫(ρε+μS2)dV$P=\int (\rho \epsilon +\mu S^2)dV$(6)

其中，τ$\tau$為剪切應力，Pa；ρ$\rho$為流體密度，kg/m3；μ為流體動力黏度，Pa?s；k為湍流動能，m2/s2；S為剪切應變率，s-1。ρk$\rho k$為湍流剪切應力，μS$\mu S$為黏性剪切應力。

2 實驗結果與討論

2.1 傳質系數(shù)

傳質性能是細胞培養(yǎng)反應器的關鍵指標，決定了氧氣的供給和CO2廢氣的排放。細胞生長增殖一段時間后，其進一步生長將受到培養(yǎng)環(huán)境中溶解氧的限制。培養(yǎng)所能達到的密度、細胞狀態(tài)以及生長代謝情況都與培養(yǎng)體系中的溶氧濃度有著直接的關系，同時CO2的分壓還會影響培養(yǎng)體系的酸度。

體積傳質系數(shù)kLa是液膜傳質系數(shù)kL（m/s）與傳質比表面積a（m2/m3）的乘積。靜止的培養(yǎng)瓶內kL僅受O2和CO2在液體中的擴散系數(shù)影響，而a=1/h$a=1/h$，即其液層高度的倒數(shù)[7]。運動過程中，kL和a還受界面更新和能量耗散率的影響。運動不但使氣液界面發(fā)生形變，增大傳質面積，還通過拉伸與壓縮氣液界面降低液膜傳質阻力[20-21]。此外，T25培養(yǎng)瓶瓶蓋上的無菌過濾膜還可能產生額外的傳質阻力，后者甚至可能成為限制氧傳遞的主要因素。為了研究其影響，使用注射器針頭刺穿過濾膜直接向瓶內注入空氣，并與帶過濾膜的培養(yǎng)瓶以及開口的培養(yǎng)瓶的傳質速率進行了比較。圖3展示了幾種典型的操作條件組合下溶氧從0達到飽和的過程曲線。結果表明，不同操作條件下的傳氧速率有明顯差別。30 r/min時由于直接向瓶內通入空氣，溶氧達到飽和的速率比40 r/min要高，說明瓶蓋處的空氣濾膜對氧傳遞有較大的負面影響。

圖3

圖3   不同振蕩轉速與換氣方式組合下T25培養(yǎng)瓶中溶氧變化

a—置換氮氣,開口無瓶蓋;b—置換氮氣,刺穿瓶蓋通空氣;c—置換氮氣,蓋瓶蓋,不通空氣;d—未置換氮氣,刺穿瓶蓋通空氣

Fig.3   Evolution of dissolved oxygen under different combinations of rocking speed and aeration method

為了對比不同的通氣方式下過濾膜對傳質的影響，圖4進一步對不同的操作條件組合下的kLa進行了定量分析。需要指出，式（1）可以用來擬合任何一階響應過程，即便溶氧響應曲線是由瓶蓋上的過濾膜決定的，其響應曲線仍然可能符合式（1）。因此，圖4中給出的kLa只能認為是“表觀傳質系數(shù)”，即綜合各因素表現(xiàn)出的傳質系數(shù)。若非另有說明，本文討論的kLa均為表觀值。

圖4

圖4   振蕩轉速對T25培養(yǎng)瓶表觀傳質系數(shù)的影響

a—置換氮氣,開口無瓶蓋;b—置換氮氣,刺穿瓶蓋通空氣;c—置換氮氣,蓋瓶蓋,不通空氣;d—未置換氮氣,刺穿瓶蓋通空氣

Fig.4   Effect of rocking speed on the apparent mass transfer coefficient

從圖4中分析得到，在置換氮氣后不通空氣條件下，T25培養(yǎng)瓶低轉速下（< 60 r/min）開口（a）和蓋瓶蓋（d）的kLa并無明顯差別，說明傳質阻力主要在氣液界面，而不是瓶口的過濾膜。當轉速達到60 r/min及以上時，開口（a）的kLa明顯大于蓋瓶蓋（d）。具體的，60 r/min以下時培養(yǎng)瓶內Re小于1000，處于層流區(qū)，因此液膜阻力對擴散傳質起主導作用，瓶蓋上的空氣濾膜的影響不明顯；60 r/min時開始向湍流區(qū)過渡，液膜傳質阻力開始降低，空氣濾膜影響瓶內、外的氣體交換進而影響瓶內氣相中的氧氣分壓和傳質速率。通過刺穿空氣濾膜直接通氣的情況下，表觀傳質系數(shù)在所有轉速下都高于不通氣的操作。在蓋瓶蓋且強制通氣條件下，T25培養(yǎng)瓶置換（b）與不置換（c）氮氣無明顯差別，這是由于本實驗中置換氮氣所需的時間遠遠小于溶氧達到飽和所需的時間。

Nienow等[22]研究了一株工業(yè)CHO細胞在微型攪拌釜生物反應器（賽多利斯ambrTM 15）內表達IgG4時的傳質性能。以水作反應體系時，在裝液量為13 ml、轉速1500 r/min、氣速1.0 ml/min下達到較高的kLa=17.58 h-1。在T25培養(yǎng)瓶中，轉速達到60 r/min以上時，圖4中的四種條件全部達到或超過了該水平。在刺穿空氣濾膜直接通空氣時，80 r/min的kLa超過了ambrTM 15的兩倍。這主要是培養(yǎng)瓶的比表面積遠大于ambrTM15微型攪拌釜，且振蕩的方式使氣液界面發(fā)生形變與攪拌相比能效更高。上述分析表明，振蕩的培養(yǎng)瓶更適合對剪切敏感且耗氧量大或密度較高的細胞培養(yǎng)。

綜上所述，隨著振蕩轉速提高，T25培養(yǎng)瓶的體積傳質系數(shù)kLa提高。振蕩轉速高時，氣液界面變化快，交界面積大，流動形態(tài)更不規(guī)則，更新速率加快，根據(jù)穿透理論，傳質系數(shù)應該更高。若剪切應力在可以承受的范圍內，可以選擇較高的振蕩轉速進行細胞培養(yǎng)，以支撐更高的細胞密度。也可在瓶蓋上整合一個連接潔凈氣體的微型接口，適當通入氧氣或空氣，提高氣相中的氧分壓，促進氧傳遞。

2.2 液相混合

混合特性是衡量生物反應器性能的另一關鍵指標。T25培養(yǎng)瓶體積較小，湍流程度也較低，混合時間不能忽視。尤其是進行高密度培養(yǎng)時，混合可能會影響細胞微環(huán)境的均一性。本研究使用示蹤劑比色法研究T25培養(yǎng)瓶不同操作條件下的混合時間。典型的70 r/min培養(yǎng)瓶混合過程中原始視頻幀、處理后的紅色光吸收以及CFD模擬結果如圖5所示。與其對應的混合過程吸光度標準差隨時間的變化如圖6所示?；旌蠒r間定義為標準差達到最終穩(wěn)態(tài)值的5%內所需的時間。

圖5

圖5   70 r/min 時T25培養(yǎng)瓶混合情況及紅色光吸收情況與CFD模擬結果的比較

左—原始視頻幀;中—紅色光吸光度;右—CFD模擬結果

Fig.5   Red light absorbance after tracer addition under 70 r/min rocking compared with CFD simulation

圖6

圖6   70 r/min時T25培養(yǎng)瓶混合過程紅色光吸光度標準差

Fig.6   Evolution of the standard deviation of red light absorbance under 70 r/min rocking

由于翹板搖床上可以放置甚至堆疊多個T25培養(yǎng)瓶，不同位置的培養(yǎng)瓶的重心與搖床旋轉軸相對位置不同，有可能會影響傳質與混合。圖7考察了培養(yǎng)瓶與旋轉軸相對位置對混合時間的影響。結果表明，在翹板搖床中央正放、左側正放以及中央墊高2.5 cm正放三個條件下，混合時間沒有明顯差別，即培養(yǎng)瓶距離旋轉中心的水平和垂直距離對混合時間的影響不明顯。這說明影響流體力學性質的是角向加速度（各處相同）而不是線速度（各處不同），符合慣性系統(tǒng)預期。在培養(yǎng)瓶中心軸與擺動轉軸成45°放置條件下，培養(yǎng)瓶的瓶壁起到了擋板的作用，混合時間明顯小于其他三個條件。在培養(yǎng)瓶中加入覆蓋培養(yǎng)瓶底部約2/3區(qū)域直徑為2 mm的玻璃珠，不同轉速下的混合情況如圖8所示。與常規(guī)操作相比，加入玻璃珠混合時間大大縮短。由圖7、圖8分析可得，無論培養(yǎng)瓶與旋轉軸相對位置如何，有無加入玻璃珠，當振蕩頻率從30 r/min增加到70 r/min時，混合時間都有明顯縮短，從10 min以上降低到1 min以下量級。

圖7

圖7   振蕩轉速和旋轉軸位置對T25培養(yǎng)瓶混合情況的影響

a—正放;b—培養(yǎng)瓶中心軸與擺動轉軸成45°;c—墊高;d—偏左

Fig.7   Effect of rocking speed and axial position on the mixing time

圖8

圖8   玻璃珠對T25培養(yǎng)瓶混合時間的影響

a—中央正放不加玻璃珠;b—中央正放加玻璃珠

Fig.8   Effect of glass beads on the mixing time

以上分析表明，在翹板搖床上放置多個培養(yǎng)瓶時，不同位置上的培養(yǎng)條件應該十分接近，可以用于培養(yǎng)基的優(yōu)化等對平行性要求較高的實驗。在不影響細胞生長的情況下，在培養(yǎng)瓶中加入不發(fā)生反應且對細胞無害的固形物以及設置擋板等有利于反應器內的混合與傳質，同時也會增加剪切應力，或可模擬大規(guī)模生物反應器細胞培養(yǎng)時的高剪切環(huán)境。

2.3 CFD數(shù)值模擬

2.3.1 網格無關性驗證

首先通過考察網格數(shù)量對計算域內的平均液速的影響進行網格無關性分析。以速度大小改變量不超過3%確定最佳網格數(shù)量。在80 r/min下使用SST k-ω模型在不同網格數(shù)量下計算域內平均液速隨時間的變化，結果如圖9所示。最終確定模型的網格單元數(shù)為344×103。

圖9

圖9   80 r/min下不同網格數(shù)量下計算域內平均液速隨時間變化曲線

Fig.9   Grid-independence test by monitoring mass-average liquid velocity magnitude at 80 r/min

2.3.2 過渡區(qū)模型的選擇

T25培養(yǎng)瓶在40 r/min和50 r/min時，Re分別是637和797，處于過渡區(qū)[17]。對層流-湍流過渡區(qū)的準確模擬，尤其是使用通用的CFD方法進行并行計算求解是非常困難的[8, 23]。以40 r/min為例，本文考察幾種常用的過渡區(qū)模型，并通過與20 r/min的Laminar模型與60 r/min的SST k-ω模型進行比較，以便選擇較合適的模型進行進一步分析。從圖10可以看到，四種過渡區(qū)模型給出的40 r/min時液速值均處于20 r/min與60 r/min對應值之間，符合預期。但對于剪切應力而言，40 r/min只有層流模型的剪切應力在20 r/min與60 r/min之間，Transition k-kl-ω模型明顯高于60 r/min，其余兩模型低于20 r/min；對于能量耗散率而言，40 r/min的Laminar模型同樣在20 r/min與60 r/min之間，符合實際情況。綜合分析，40 r/min過渡區(qū)的情況用通用的湍流模型可能無法準確模擬，后續(xù)討論中用Laminar層流模型近似求解。

圖10

圖10   不同模型與轉速的CFD模擬結果

Fig.10   CFD simulation results by different turbulent models under different rocking speeds

2.3.3 混合時間

在計算流體力學模型求解達到擬穩(wěn)態(tài)后（即平均液速呈現(xiàn)有規(guī)律的周期性變化時），在X=0 m，Y=0.005 m，Z=0.003 m處添加0.05 ml質量分數(shù)為0.001的液相示蹤劑并啟用組分傳輸方程，繼續(xù)采用瞬時法模擬示蹤劑在計算域內的混合過程。求解過程中，在計算域內的不同位置選擇多個點監(jiān)測示蹤劑的濃度變化。混合時間定義為所有監(jiān)測點的示蹤劑濃度落入最終穩(wěn)態(tài)值的5%內所需的時間。混合均勻后，模擬結束。

圖11給出了70 r/min時T25培養(yǎng)瓶內5個監(jiān)測點處（圖11插圖）示蹤劑質量分數(shù)變化（五條彩色曲線）以及實驗測定混合過程紅色光吸光度標準差變化（原始信號與FFT濾波后信號）。插圖中，中央黑色圓點為示蹤劑加樣位置，其余灰色點為選定監(jiān)測點位置。距離示蹤劑添加位置較近的監(jiān)測點，初始示蹤劑濃度高；反之則初始濃度幾乎為零。前者逐漸降低，后者逐漸增加，直至趨于平衡。FFT濾波后的紅色吸收光標準差變化也逐漸平衡。CFD模擬的混合時間與實驗測定結果的吻合程度較高，證明相應的模擬方法可以用于混合時間的分析研究，也驗證了模型的有效性。

圖11

圖11   混合過程中培養(yǎng)瓶內不同位置示蹤劑質量分數(shù)變化與紅色吸收光標準差

Fig.11   Evolution of tracer mass fraction at five different points in the T-flask during mixing and the standard deviation of red light absorbance

2.3.4 氣液界面形狀及面積

本研究所用的細胞培養(yǎng)瓶屬于振蕩型微型反應器。這類反應器由于不存在分散于液相的氣泡，傳質面積完全取決于液面面積。一般說來，氣液界面的形狀受振蕩產生的離心力和液體的表面張力決定。具體的，表面張力越高，靜止時界面面積越小，發(fā)生形變需要的臨界轉速越高；超過臨界轉速后，轉速越高，界面形變也越大。Hermann等[24]研究了96孔板在不同振蕩頻率下的液面形狀，發(fā)現(xiàn)當振蕩半徑為25 mm時，振蕩頻率達到200 r/min才能觀察到肉眼可見的液面形變。Kensy等[25]在48孔板進行實驗時，也有高轉速比低轉速液面形變明顯的結果。T25培養(yǎng)瓶較孔板而言，氣液交界面較大，應在較低轉速下即可發(fā)生較大形變。

圖12（a）是本研究中T25培養(yǎng)瓶瓶體在翹板搖床不同轉速下達到流體力學擬穩(wěn)態(tài)后再回到水平位置時，在Y=0.5 cm截面氣液兩相的相對狀態(tài)，圖12（b）是實驗過程中氣液界面形狀的照片。結果表明，CFD模擬結果與攝像頭捕獲結果相似，在10~50 r/min時氣液界面上的形態(tài)沒有明顯差別，皆幾乎與水平面平行。而在60~80 r/min時系統(tǒng)開始進入湍流狀態(tài)，瓶內液體的相對運動狀態(tài)發(fā)生明顯變化，氣液界面出現(xiàn)明顯擾動，面積增大。圖13是CFD模擬培養(yǎng)瓶內速度大小分布云圖，圖14為不同轉速下的氣液界面面積隨振蕩時間變化的CFD模擬結果。隨著轉速提高，氣液界面的面積增大，流動形態(tài)更不規(guī)則，液面更新速率加快，這解釋了傳質系數(shù)隨振蕩頻率增加的現(xiàn)象（圖4）。

圖12

圖12   T25培養(yǎng)瓶在20~80 r/min轉速下氣液界面狀態(tài)

Fig.12   Shape of the gas-liquid interface under 20—80 r/min rocking

圖13

圖13   不同轉速下T25培養(yǎng)瓶速度分布云圖

Fig.13   Contours of velocity magnitude in T25 flasks under different rocking speeds

圖14

圖14   不同轉速下氣液界面面積隨時間的變化

Fig.14   Variation of the gas-liquid interfacial area under different rocking speeds

2.3.5 剪切應力

剪切是動態(tài)反應器中細胞損傷的主要原因之一，當剪切作用超出細胞膜形變極限時，細胞膜破裂細胞死亡。在使用微載體進行細胞培養(yǎng)時，即便剪切應力不至于直接造成細胞死亡，也可能將細胞從微載體上剝離。本研究中，振蕩轉速低于40 r/min時培養(yǎng)瓶內的流動為層流，剪切主要為黏性剪切，轉速高于60 r/min時，流動開始進入湍流區(qū)，此時總的剪切應力需加上湍流的作用，通過式（5）計算總的剪切應力。若要較為準確地模擬湍流剪切應力應使用雷諾應力模型（RSM），由于本研究涉及的60、80 r/min雷諾數(shù)較低，k?ω$k-\omega$模型可以滿足此處討論之需要。20 r/min處于層流區(qū)，使用Laminar模型，40 r/min處于過渡區(qū)，通過前文比較研究選擇Laminar模型近似模擬。根據(jù)式（5）計算的不同轉速下一個振蕩周期內的平均剪切應力如圖15所示。結果顯示，隨著轉速的增高，平均剪切應力的強度成指數(shù)增加趨勢。Ghasemian等[26]研究用于干細胞培養(yǎng)的125 ml轉瓶（裝液量50 ml）和150 ml滾瓶的流體動力學特征時，得出常用操作條件下二者的平均剪切應力范圍為0.015~0.046 Pa和0.019~0.044 Pa，范圍比本研究所用的方瓶要窄。搖床往復運動改變方向時瓶壁起擋板作用，以及搖床帶動整個培養(yǎng)瓶內全部液體同時運動相比轉瓶和滾瓶能提供更高的能量輸入，使得剪切應力增大。當用于培養(yǎng)工藝研究時，振蕩的T25培養(yǎng)瓶能更接近大規(guī)模培養(yǎng)反應器內的情況。

圖15

圖15   轉速對質量加權平均剪切應力影響

Fig.15   Effect of rocking speed on the spatio-temporal mass-average shear stress

剪切應力的平均值并不能完全代表它對細胞產生的可能影響，還要考慮培養(yǎng)瓶流場中是否存在局部應力高于細胞承受能力的區(qū)域。20、40、60、80 r/min轉速下剪切應力的分布情況如圖16所示。結果表明，不同轉速下的高剪切應力都集中分布在培養(yǎng)瓶瓶壁尤其底面和氣液交界面的位置，液層中中間區(qū)域的剪切應力明顯小于各個接觸面。80 r/min時平均剪切應力<200 mPa，而接近瓶底處將近700 mPa，這是較低雷諾數(shù)下以黏性剪切為主時，無滑動邊界條件的必然結果。振蕩的T25培養(yǎng)瓶在較小的體積下能更接近大型反應器，適合用于高通量縮小模型研究。Li等[27]研究口蹄疫滅活疫苗生產中4000 L細胞培養(yǎng)過程的縮小模型時，模擬了14、800和4000 L生物反應器葉輪轉速分別為66、48和44 r/min時的剪切應力，發(fā)現(xiàn)最大剪切應力在10~100 mPa之間，與T25培養(yǎng)瓶中40 r/min以及60 r/min的模擬結果較為相似。

圖16

圖16   不同轉速下T25培養(yǎng)瓶內剪切應力分布云圖

Fig.16   Contours of shear stress in a T25 culture flask under different rocking speeds

2.3.6 能量耗散

對于細胞生物反應器，能量耗散率ε是決定傳質、混合和剪切特性的重要因素。ε的宏觀表現(xiàn)是比功率輸入，俗稱P/V（W/m3），其中P（W）是輸入總功率，V（m3）是反應器中液體體積。對于傳統(tǒng)的攪拌釜反應器，P可以通過轉矩測量較為準確地獲得，也有比較可靠的經驗、半經驗公式進行估算[28-29]。對于微型反應器，包括本研究中所使用的T25方瓶，實驗測量功率輸入比較困難，但可以通過式（6）計算得到。不同轉速下一個振蕩周期內的平均能量耗散率如圖17所示。與攪拌釜反應器類似，能量耗散率隨轉速的提高呈指數(shù)上升趨勢[30]。80 r/min時的能量耗散率與其他三個轉速有明顯的區(qū)別，20、40、60 r/min時的能量耗散率都在較低范圍內小幅度波動，而80 r/min時，能量耗散率波動幅度劇烈增大，整體的能量耗散率變高，在時間和空間上極不均勻。圖18為在幾個不同轉速下能量耗散率的分布情況，與圖15對照可以看出速度高的位置能量耗散率則越高，靠近液面處速度快速降低，能量耗散率也有一定下降。

圖17

圖17   轉速對質量加權平均能量耗散率影響

Fig.17   Effect of speeds on the mass average ε

圖18

圖18   T25培養(yǎng)瓶能量耗散率分布云圖

Fig.18   Contours of the ε distribution in T25 flasks

Nienow等[22]在對ambr? 15微型攪拌釜反應器的CFD模擬中發(fā)現(xiàn)在1500 r/min的攪拌轉速下，ambr? 15內的液體流動和能量耗散集中在攪拌槳周圍較小的區(qū)域內，靠近液面處液體流動速度同樣迅速下降。李雪良等[8]對ambr? 15及ambr? 250進行了更加詳細的CFD模擬，結合實驗認為模擬的結果可以用于指導反應器放大，但同時也指出由于ambr? 15內的流動處于從層流到湍流的過渡區(qū)，使用湍流模型進行CFD模擬會有較大誤差。

3 結 論

通過對置于翹板搖床上的T25培養(yǎng)瓶在不同操作條件下的流體動力學和混合傳質特性進行系統(tǒng)性分析，得出以下結論。

(1) 振蕩轉速對傳質系數(shù)具有決定性作用，換氣方式對傳質速率也有一定影響。T25培養(yǎng)瓶綜合傳質系數(shù)可達20~30 h-1，高于相同體積的微型攪拌釜反應器。

(2) 振蕩轉速對混合時間具有巨大影響，從30~80 r/min，混合時間由數(shù)十分鐘降低至1 min以下，在培養(yǎng)瓶中加入擋板和玻璃珠可明顯促進混合。

(3) VOF模型結合動態(tài)網格可以對搖瓶內的多相流運動及混合情況較好模擬，用以獲得較難通過實驗直接測量的性能參數(shù)。

(4) 高轉速下，T25培養(yǎng)瓶中剪切應力和能量耗散率在時間與空間上分布極不均勻。瓶壁與氣液交界面處局部剪切應力較高，但與市售微型攪拌釜反應器接近。

振蕩的T25方瓶最有價值的應用可能還包括微載體懸浮培養(yǎng)，這有待進一步研究。

符 號 說 明