金屬納米顆粒輔助木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵生物制氫的研究進(jìn)展

引 言

隨著人口和工業(yè)化的快速增長，全球?qū)δ茉吹男枨笕找嬖黾?，化石燃料儲備有限且會對環(huán)境造成不利影響，因此尋找代替化石燃料的可再生能源成為全世界廣泛關(guān)注的問題[1]。相比其他能源，氫氣具有可再生、零排放、能量密度高、熱效率高等優(yōu)勢，使其成為21世紀(jì)備受重視的清潔能源[2]。氫能源來源廣泛，不僅可以來自天然氣、石油、煤炭等天然資源，還可以通過電解水產(chǎn)生[3]。目前，以廢棄生物質(zhì)為原料通過微生物制氫也成為氫氣的一個(gè)重要來源，這些有機(jī)廢物原料可再生，來源廣泛可大量獲得，使得生物制氫具有廣闊的發(fā)展前景[4-5]。

生物制氫主要有四種途徑：光解水產(chǎn)氫、光發(fā)酵產(chǎn)氫、暗發(fā)酵產(chǎn)氫和光-暗聯(lián)合發(fā)酵產(chǎn)氫[6-9]。暗發(fā)酵由于無須光照、產(chǎn)氫速率快、耗能低、微生物類群廣泛且可使用多種有機(jī)底物，是生物制氫最常用的工藝[10-12]。Web of Science引文索引中2004~2020年間涉及生物制氫各種主要方法的文章發(fā)表數(shù)量如圖1(a)所示?？芍蛋l(fā)酵產(chǎn)氫相關(guān)的文章數(shù)量明顯高于其他幾種方法，且隨年份呈現(xiàn)迅速增長趨勢，近五年來尤為顯著，2020年發(fā)表的文章數(shù)量接近250篇。相比之下其他幾種生物制氫方法的文章數(shù)量較少且隨年份增長緩慢。暗發(fā)酵產(chǎn)氫主要通過三種途徑：丁酸型發(fā)酵、混合酸發(fā)酵以及NADH途徑。參與暗發(fā)酵的碳水化合物主要是葡萄糖，主要產(chǎn)生乙酸、丁酸與氫氣，具體反應(yīng)式如式（1）~式（4）：

C6H12O6+2H2O2CH3COOH+2CO2+4H2(1)C6H12O6CH3CH2CH2COOH+2CO2+2H2(2)C6H12O6+H2OCH3COOH+C2H5OH+2H2+2CO2(3)NADH+H+NAD++H2(4)

圖1

圖1   木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵生物制氫及相關(guān)納米顆粒的文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析

Fig.1   Bibliometric analysis of dark fermentative bio-hydrogen and related MNPs

可以看出，暗發(fā)酵生物制氫的最高產(chǎn)氫率為4 mol H2/(mol葡萄糖)，60%以上的產(chǎn)物為乙酸、丁酸、乙醇等物質(zhì)，產(chǎn)氫量低、底物轉(zhuǎn)化率低是暗發(fā)酵存在的問題[8-9, 13]。在各種有機(jī)底物中，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是最合適的底物，因?yàn)槠鋯误w形式的葡萄糖含量高[14]，且來源廣泛，例如可從稻草秸稈、甘蔗渣、玉米芯和木屑等中獲得[9]。木質(zhì)纖維素的高纖維素含量、可再生性和巨大的可利用性使其成為大規(guī)模生物制氫最常用的有機(jī)基質(zhì)，其暗發(fā)酵制氫過程如圖1(b)[8]。

然而木質(zhì)纖維素中含有大量難降解的木質(zhì)素（10%~25%），木質(zhì)素通過化學(xué)鍵與半纖維素結(jié)合并將纖維素包裹在其中，阻礙了對纖維素的利用[15-16]，因此必須進(jìn)行預(yù)處理以促進(jìn)纖維素的暴露、提高其水解生成單糖的效率。針對木質(zhì)纖維素的預(yù)處理，已經(jīng)發(fā)展了許多物理、化學(xué)和生物手段，但這些方法都存在不足，例如物理方法能耗高，化學(xué)法成本高且會產(chǎn)生對環(huán)境有害的廢物，生物法反應(yīng)速率慢、產(chǎn)量低[17-18]。這些方法由于成本較高不適合投入工業(yè)應(yīng)用，因此需要開展深入研究以提高木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵生物制氫的效率[19]。暗發(fā)酵生物制氫效率低主要受制于暗發(fā)酵本身產(chǎn)氫率與底物轉(zhuǎn)化率低這兩個(gè)方面的原因，而這兩個(gè)過程都具有的共同點(diǎn)是受酶的控制。在木質(zhì)纖維素的預(yù)處理過程中，由于缺乏對木質(zhì)素的有效降解以及纖維素酶水解效率低、生產(chǎn)成本高，導(dǎo)致產(chǎn)氫量較少。而在暗發(fā)酵過程中氫化酶通過催化質(zhì)子還原起著至關(guān)重要的作用，酶的催化效率低直接導(dǎo)致產(chǎn)氫效率低。因此，酶起著控制整個(gè)生物制氫過程的關(guān)鍵作用[9]，通過提高酶的性能是提高生物制氫效果直接快速的手段。此外，微生物細(xì)胞的代謝活動(dòng)、細(xì)胞之間以及菌群之間的相互作用也會對暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程產(chǎn)生影響。

納米材料（nanomaterials）具有量子尺寸效應(yīng)、比表面積大、電導(dǎo)率高等特點(diǎn)[20-21]，展現(xiàn)出高效的吸附能力和催化效率，且可以在非常低的濃度下誘導(dǎo)微生物代謝，在生物技術(shù)中有廣闊的應(yīng)用前景[22-27]。近年來，納米技術(shù)作為生物科學(xué)領(lǐng)域前沿技術(shù)，有望成為克服暗發(fā)酵瓶頸的新手段[5, 8, 28]。通過對暗發(fā)酵生物制氫文章的主題、關(guān)鍵詞進(jìn)行熱度分析[圖1(c)]，可以看出納米材料的出現(xiàn)頻率很高且與暗發(fā)酵關(guān)系緊密。近年來，金屬納米顆粒（metal nanoparticles，MNPs）已經(jīng)被利用于改善生物制氫[23-26, 29-30]。圖1(d)展示了2013~2021年應(yīng)用于暗發(fā)酵生物制氫的各種金屬納米材料顆粒發(fā)文數(shù)量占比，其中最常用的是鐵和鎳納米顆粒（占比超過60%），以及鈷、銀、銅、鋅等。金屬納米材料在暗發(fā)酵生物制氫中的作用主要有：（1）提高酶的穩(wěn)定性，增加生物預(yù)處理過程中木質(zhì)素和半纖維素的去除[31]和纖維素的水解，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)氫量的提高[1, 8-9, 32-33]；（2）消耗暗發(fā)酵過程中不需要的氧，降低氧化還原電位[9, 23-24, 30]，促進(jìn)氫化酶的合成和活性的提高；（3）影響暗發(fā)酵產(chǎn)氫體系中微生物細(xì)胞的代謝，促進(jìn)細(xì)胞電子傳遞；（4）影響暗發(fā)酵產(chǎn)氫體系中微生物的群落結(jié)構(gòu)。本文介紹了金屬納米顆粒輔助木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵生物制氫的機(jī)理及影響因素，總結(jié)了各種金屬納米顆粒應(yīng)用于暗發(fā)酵生物制氫的研究進(jìn)展，并對仍存在的難題及前景進(jìn)行了總結(jié)與展望。

1 金屬納米顆粒的生物相容性及與酶的作用機(jī)理

1.1 金屬納米顆粒的生物相容性

納米顆粒通常指直徑在1~100 nm范圍內(nèi)的粒子[7]。金屬納米顆粒具有量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和優(yōu)異的導(dǎo)電性能，這使其展現(xiàn)出良好的生物相容性。在濃度為0.01 mg/ml時(shí)，直徑為70 nm的納米顆?？商峁?.8 m2/L的總表面積。納米顆粒微小的尺寸使其能被細(xì)胞吸收，從而與細(xì)胞發(fā)生作用[34]。如圖2所示，直徑小于100 nm的顆粒可以通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（receptor mediated endocytosis）進(jìn)入細(xì)胞[35]。此外，納米顆粒還可以被蛋白質(zhì)包裹并與其結(jié)合，或停留在細(xì)胞表面[34]。附著在細(xì)胞表面的金屬納米顆?？梢耘c細(xì)胞膜上的酶或受體蛋白發(fā)生作用，還能作為一些微生物細(xì)胞進(jìn)行胞外呼吸的末端電子受體。納米顆粒微小的體積和巨大的比表面積有利于細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的電子傳遞[6-7]。細(xì)胞內(nèi)的金屬納米顆粒通過加快水解和產(chǎn)酸過程中酶組之間的電子傳遞速率，促進(jìn)有機(jī)物的氧化，從而促進(jìn)微生物的代謝過程[36]。

圖2

圖2   納米顆粒與細(xì)胞的作用（受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用：納米顆粒被蛋白質(zhì)冠層包裹）[35]

Fig.2   Interaction between nanoparticles and cell（receptor mediated endocytosis: nanoparticles are coated by a protein corona）[35]

1.2 金屬納米顆粒與酶及微生物的作用機(jī)理

鐵、鎳、鈷、鎂、錳、鋅、銅等多種金屬以宏量和微量元素的形式構(gòu)成微生物的營養(yǎng)介質(zhì)[37-39]，這些金屬及其氧化物納米顆粒即使在低濃度下也可能產(chǎn)生很大的影響[8, 40]。金屬納米顆?？梢酝ㄟ^固定或吸附機(jī)質(zhì)顯著改變反應(yīng)介質(zhì)，并表現(xiàn)出優(yōu)異的催化性能[41]。此外，改性后的金屬納米顆粒還可以從反應(yīng)介質(zhì)中回收，用于后續(xù)的反應(yīng)[42]。近年來，學(xué)者們通過研究揭示了納米顆粒對酶的產(chǎn)生和效率的影響。圖3顯示了酶與納米顆粒的不同附著/固定模式[43]，主要包括：酶在納米顆粒上的非共價(jià)物理吸附、酶與納米粒子的共價(jià)結(jié)合（多點(diǎn)附著）、酶的共價(jià)交聯(lián)以及通過膠束將酶微囊化。這些作用均可以對纖維素酶的穩(wěn)定性和水解效率產(chǎn)生促進(jìn)作用。

圖3

圖3   通過共價(jià)和非共價(jià)力引入納米顆粒促進(jìn)酶的穩(wěn)定化[43]

Fig.3   Enzyme stabilization by immobilization introduces additional covalent and non-covalent forces to nanoparticles[43]

金屬及其氧化物納米顆粒對酶的產(chǎn)生和活性有積極影響。Kumar等[44]揭示了過渡金屬氧化物如Fe2O3納米顆粒（Fe2O3NPs）不僅顯示出高效的催化性能及對反應(yīng)介質(zhì)的改善，且對酶的固定化效率達(dá)60%~80%。金屬納米顆粒的復(fù)合形式（nanocompostie particles）如Fe3O4/藻酸鹽納米復(fù)合顆粒能夠防止培養(yǎng)基在高濃度下中毒，并保持微生物群落的活性，提高酶的產(chǎn)量[45]。此外，金屬納米顆粒還可以通過改變微生物的新陳代謝和菌絲生長來影響微生物生長，從而提高酶的產(chǎn)量[46]。

2 金屬納米顆粒對木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵產(chǎn)氫相關(guān)酶的影響

2.1 金屬納米顆粒促進(jìn)木質(zhì)纖維素水解影響產(chǎn)氫的作用機(jī)理

金屬納米顆粒用于木質(zhì)纖維素的預(yù)處理主要包括兩個(gè)方面：（1）使用功能化金屬納米顆粒直接水解木質(zhì)纖維素；（2）通過吸附或共價(jià)鍵結(jié)合將水解酶固定在金屬納米顆粒上，強(qiáng)化酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性能。

2.1.1 功能化金屬納米顆粒對木質(zhì)纖維素的預(yù)處理

為使金屬納米顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)對木質(zhì)纖維素的高效降解，需要對其進(jìn)行功能化改性，例如采用磁性金屬內(nèi)核、用化學(xué)試劑修飾納米顆粒表面等。目前對功能化金屬納米顆粒預(yù)處理木質(zhì)纖維素的研究主要集中在酸功能化磁性金屬納米顆粒（acid-functionalization magnetic nanoparticles）。由于納米顆粒具有很大的比表面積，其表面能夠負(fù)載大量的酸，并且納米顆粒微小的尺寸使它容易穿過木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的細(xì)胞壁，與其中的木質(zhì)纖維素相互作用[47]。酸功能化磁性納米顆粒對木質(zhì)纖維素的預(yù)處理與酸化學(xué)法預(yù)處理類似，但其表面能夠與 —SO3H、—COOH、—OH等酸性基團(tuán)結(jié)合，提供大量酸性位點(diǎn)，并且具有磁性的金屬納米顆粒還可以回收循環(huán)利用，避免了傳統(tǒng)化學(xué)預(yù)處理中酸的大量使用，大大降低了處理成本[48]。Gill等[49]最早合成了烷基磺酸和全氟烷基磺酸功能化的二氧化硅包覆的磁性納米顆粒（AS-SiMNPs和PS-SiMNPs）[圖4（a）]，他們認(rèn)為在這些磁性納米顆粒表面形成的H3O+通過水解反應(yīng)促進(jìn)纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。Pe?a等[50]研究了全氟烷基磺酸和烷基磺酸功能化的CoFe2O4納米顆粒（PS-Co-MNPs和AS-Co-MNPs）對纖維素二糖的水解作用，發(fā)現(xiàn)AS-Co-MNP通過破壞β-1,4-糖苷鍵實(shí)現(xiàn)纖維素二糖的水解[圖4（b）]，使纖維素二糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到78%。Wang等[42]隨后又研究了PS-Co-MNPs和AS-Co-MNPs對麥草秸稈預(yù)處理中半纖維素向低聚糖的轉(zhuǎn)化。在80℃處理24 h后，PS-Co-MNPs溶解了24.0%的半纖維素，而AS-Co-MNPs實(shí)驗(yàn)組和無添加對照組中半纖維素的溶解率僅為9.1%和7.7%。在160℃處理2 h后，PS-Co-MNPs和AS-Co-MNPs對半纖維素的轉(zhuǎn)化率分別為66.3%和61.2%，而對照組僅為50.9%。Su等[51]制備了一種磺化磁性碳酸納米顆粒（C-SO3H/Fe3O4NPs）并應(yīng)用到木質(zhì)纖維素的水解處理中，處理后甘蔗渣的葡萄糖產(chǎn)率達(dá)79.8%。Ingle等[52]分別用兩種酸功能化磁性納米顆粒（Fe3O4-MNPs-Si-AS和Fe3O4-MNPs-Si-BCOOH）強(qiáng)化甘蔗秸稈的預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)添加量均為500 mg/L時(shí)得到的糖產(chǎn)量最高，分別為17.06 g/L和15.40 g/L，而僅用硫酸預(yù)處理和無處理的樣品的糖產(chǎn)量分別為14.63 g/L和0.24 g/L。將酸功能化金屬納米顆粒應(yīng)用于強(qiáng)化木質(zhì)纖維素化學(xué)預(yù)處理，以及通過金屬納米顆粒強(qiáng)化酶的生物法預(yù)處理，具有巨大發(fā)展?jié)摿Γ欢?，由于金屬納米顆粒用于生物質(zhì)預(yù)處理尚處于起步階段，目前有關(guān)功能化金屬納米顆粒處理木質(zhì)纖維素的報(bào)道非常少[53]，相關(guān)的機(jī)理和進(jìn)一步的應(yīng)用還需要進(jìn)行更多的探索和研究。

圖4

圖4   酸功能化磁性納米顆粒對木質(zhì)纖維素的水解[49-50]

Fig.4   Hydrolysis of lignocellulose by functionalized magnetic nanoparticles[49-50]

2.1.2 金屬納米顆粒對酶的固定化作用強(qiáng)化酶對木質(zhì)纖維素的預(yù)處理

從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理到最終生物制氫的幾乎所有步驟都是由酶介導(dǎo)的，其中大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，其性質(zhì)和活性受各自的輔基影響很大。作為暗發(fā)酵生物制氫過程的關(guān)鍵控制因素，酶的三個(gè)主要操作步驟包括：（1）通過漆酶的生物預(yù)處理對木質(zhì)纖維素進(jìn)行脫木質(zhì)素；（2）通過纖維素酶將纖維素水解為葡萄糖；（3）通過氫化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為氫氣[54-55]。其中前兩個(gè)步驟屬于木質(zhì)纖維素的預(yù)處理。漆酶是一種銅氧化酶，以分子氧作為電子受體產(chǎn)生自由基，攻擊木質(zhì)素酚類化合物 Cα—Cβ鍵，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素解聚改性[56]。木質(zhì)纖維素經(jīng)第一步預(yù)處理后釋放了纖維素單體，纖維素酶將其水解成易被利用的糖類。纖維素酶是一個(gè)復(fù)雜的酶系統(tǒng)，由三個(gè)亞基組成：（1）葡萄糖內(nèi)切酶，它能切割β-(1，4)-糖苷鍵，使其還原和非還原末端暴露出來；（2）葡萄糖外切酶，它將纖維素轉(zhuǎn)化為纖維二糖和纖維寡糖；（3）β-葡萄糖苷酶，將纖維二糖和纖維寡糖轉(zhuǎn)化為單糖[9, 38, 57]。這些糖再通過暗發(fā)酵進(jìn)一步產(chǎn)生氫氣。酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性是工業(yè)應(yīng)用中需要考慮的兩個(gè)關(guān)鍵因素，因?yàn)檫@直接關(guān)系到酶預(yù)處理的效果和成本。在工業(yè)處理過程中，酶促反應(yīng)通常在高溫條件下進(jìn)行，這會導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，性能降低[58]。固定化是提高酶穩(wěn)定性和重復(fù)利用性的有效方法，納米材料憑借更大的比表面積、更強(qiáng)的負(fù)載能力以及更好的穩(wěn)定性，逐漸取代了傳統(tǒng)的固定化材料[59]。將金屬納米顆粒用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理可以在一般條件下進(jìn)行，不僅減少化學(xué)物質(zhì)的使用，還提高水解酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性[2, 24, 36, 60-61]，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的高效降解[6, 62]，使整個(gè)過程的成本大大降低。

納米顆粒通過共價(jià)結(jié)合或吸附固定在蛋白質(zhì)或酶上（如圖3），對酶的催化活性產(chǎn)生很大影響。酶被附著并固定在納米顆粒表面上，形成納米顆粒-蛋白質(zhì)冠（nanoparticle-protein corona），這種蛋白質(zhì)冠可導(dǎo)致酶系統(tǒng)的某些結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，從而增強(qiáng)納米顆粒的生物相容性[63]。在納米顆粒-蛋白質(zhì)冠形成過程中，蛋白質(zhì)在納米顆粒上的排列模式進(jìn)一步影響納米顆粒的生物活性[64]。酶蛋白對納米顆粒的親和力及其占據(jù)納米顆粒表面的能力在酶的固定化作用中起著決定性的作用[65]。酶可以通過范德華力、靜電力、疏水或π-π鍵堆積連接等非共價(jià)結(jié)合方式與金屬納米顆粒結(jié)合。然而，非共價(jià)結(jié)合存在蛋白質(zhì)從金屬納米顆粒表面脫落的問題。通過使用交聯(lián)劑（如戊二醛）實(shí)現(xiàn)酶與金屬納米顆粒的共價(jià)結(jié)合是使用最廣泛的酶固定化方法。在共價(jià)固定化技術(shù)中，納米顆粒載體表面的化學(xué)基團(tuán)被激活，并與酶蛋白質(zhì)的賴氨酸氨基側(cè)鏈、半胱氨酸的巰基、天冬氨酸和谷氨酸殘基的咪唑和酚基等發(fā)生特異性反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合，形成具有較高強(qiáng)度和穩(wěn)定性的共價(jià)鍵[66-67]。表1總結(jié)了一些學(xué)者利用金屬納米顆粒進(jìn)行纖維素酶和漆酶固定化的研究。眾多研究表明采用不同納米顆粒處理纖維素酶后，纖維素酶的穩(wěn)定性均得到提高。Cherian等[46]研究了金屬納米顆粒對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)固定在MnO2NPs上的酶在25℃下的熱穩(wěn)定時(shí)間比對照組增加了2 h。Xu等[68]將纖維素酶固定在戊二醛官能化的Fe3O4NPS上，發(fā)現(xiàn)其比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。固定化有助于提高酶對纖維素底物的親和力，因此可以獲得更好的水解性能。Srivastava等[79]用NiCo2O4NPs處理纖維素酶，與對照組在80℃下測試0~8 h，結(jié)果表明，纖維素酶在2 h和4 h內(nèi)的相對活性分別保持在63%和50%，7 h后相對活性比開始時(shí)下降了21%。與對照組相比，纖維素酶的穩(wěn)定性分別提高了68%、50%和41%。Salem等[80]將從廢棄污泥中獲得的產(chǎn)氫細(xì)菌細(xì)胞固定在Fe2O3NPs上，使比產(chǎn)氫速率由3.87 L/(L·d) 增加至5.9 L/(L·d)，H2產(chǎn)量由0.19 L H2/(g蔗糖)增加至0.3 L H2/(g蔗糖)。Ramírez[61]發(fā)現(xiàn)相較于游離纖維素酶（最適溫度為50℃，最適pH范圍為4.5~5.0），將纖維素酶固定在殼聚糖包覆的Fe3O4NPs上，催化性能提高了1.5倍，熱穩(wěn)定性提高至60℃，pH提高至5.5。且在60℃和70℃孵育4 h后，經(jīng)穩(wěn)定的纖維素酶的儲存穩(wěn)定性為初始活性的50%，而未經(jīng)穩(wěn)定的纖維素酶的活性僅為初始活性的20%。木質(zhì)素的降解主要依靠漆酶，Amin等[54]將漆酶固定在改性的Fe3O4@SiO2@KIT-6 NPs上，可以增強(qiáng)漆酶對橄欖果渣的脫木質(zhì)素作用，在35℃的最佳溫度下木質(zhì)素的去除率高達(dá)77.3%。Gou等[76]將漆酶固定在Cu2+改性的Fe3O4-NH2納米顆粒上進(jìn)行木質(zhì)纖維素的預(yù)處理，結(jié)果顯示處理后玉米芯中的木質(zhì)素降解率達(dá)40.76%，在隨后的纖維素水解過程中纖維素轉(zhuǎn)化率達(dá)到38.37%，同對照組相比提高了23.98%。

表1   各種金屬納米顆粒在纖維素酶/漆酶固定化中的應(yīng)用

Table 1  Application of MNPs on cellulose or laccase immobilization

此外，納米顆粒對酶的穩(wěn)定化還體現(xiàn)在提高酶的重復(fù)利用性和儲存穩(wěn)定性上。Tao等[72]利用Fe3O4NPs@SiO2固定纖維素酶，發(fā)現(xiàn)在50℃條件下，經(jīng)固定的纖維素酶的半衰期是未經(jīng)處理的纖維素酶的2倍，且在重復(fù)使用7個(gè)循環(huán)后，依然能保持最初活性的77%。Poorakbar等[81]制備了一種磁性介孔SiO2納米顆粒用于纖維素酶的固定，經(jīng)固定的纖維素酶在9 h后的活性能保持初始活性58%，熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性均得到提升。Abbaszadeh等[75]用銅負(fù)載的磁鐵礦納米顆粒穩(wěn)定纖維素酶，發(fā)現(xiàn)經(jīng)穩(wěn)定后的纖維素酶展現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，并且在循環(huán)使用5次后其活性依然能保持初始活性的73%，在4℃下保存8 d后，未經(jīng)穩(wěn)定和經(jīng)穩(wěn)定的纖維素酶的活性分別為初始活性的70%和84%。Manasa等[82]利用鐵酸鋅納米顆粒（Zn x Fe3-x O4NPs）固定纖維素酶，使酶的活性增加，在同樣的超聲波輔助堿性預(yù)處理?xiàng)l件下纖維素酶水解的糖產(chǎn)量增加53%，并且固定化纖維素酶的活性在60℃下保持了3個(gè)循環(huán)。Hu等[71]制備了一種利用氨基功能化磁性二氧化硅納米顆粒并研究其對漆酶的穩(wěn)定化效果，經(jīng)穩(wěn)定化的漆酶在50℃下孵育2 h后活性能保持初始活性的98%，而未經(jīng)處理的漆酶活性僅為初始活性的40%。將未經(jīng)穩(wěn)定和穩(wěn)定后的漆酶在4℃下儲存，18 d后未經(jīng)穩(wěn)定的漆酶完全失活，而穩(wěn)定后的漆酶活性仍能保持初始活性的79.25%。

2.2 金屬納米顆粒提高氫化酶活性影響產(chǎn)氫的作用機(jī)理

利用纖維素水解產(chǎn)物的暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程中只有33%的初始底物最終轉(zhuǎn)化為氫氣，而剩余67%的未利用底物最終轉(zhuǎn)化成其他代謝物如乙酸、丁酸、乙醇、丁醇、丙酮等[83]，H2產(chǎn)率低和底物轉(zhuǎn)化率低仍是該方法的主要缺點(diǎn)[84]，因此，研究者們將研究重點(diǎn)放在提高底物向氫的轉(zhuǎn)化效率和微生物活性上，以通過改變微生物代謝的穩(wěn)定性來提高產(chǎn)氫的速率和可持續(xù)性。

暗發(fā)酵生物制氫涉及多種微生物和多種酶的參與。在嚴(yán)格厭氧菌（如梭菌屬）的產(chǎn)氫過程中，葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP）途徑生成丙酮酸，隨后丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下脫氫，將電子轉(zhuǎn)移給鐵氧還蛋白，鐵氧還蛋白再將電子傳遞給氫化酶，最終在氫化酶的作用下，H+獲得電子形成H2。而在兼性厭氧菌（如腸桿菌屬）中，丙酮酸在甲酸裂解酶的作用下形成甲酸和乙酰CoA，然后在甲酸氫裂解酶的作用下產(chǎn)生CO2和H2[85]。除丙酮酸外，葡萄糖經(jīng)EMP途徑還會產(chǎn)生大量的還原型輔酶（NADH）和H+。丙酮酸經(jīng)不同代謝途徑產(chǎn)生乙酸、丁酸、乙醇及乳酸等產(chǎn)物的過程中，NADH和H+被氧化成為氧化型輔酶（NAD+），保證NADH/NAD+平衡。但當(dāng)NADH和H+消耗過程慢于形成過程時(shí)，必然會造成NADH和H+的不斷積累。為了調(diào)控平衡，在氫化酶的作用下，NADH將電子轉(zhuǎn)移給H+，從而產(chǎn)生H2。

在上述暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程中，氫化酶是起核心作用的酶。氫化酶的活性位點(diǎn)以鐵和鎳為金屬輔基，根據(jù)活性位點(diǎn)上存在的金屬可將其分為兩類：鐵-鐵氫化酶和鐵-鎳氫化酶[26]。鐵和鎳在酶活性位點(diǎn)上的存在表明這兩種金屬對暗發(fā)酵途徑有顯著影響。雖然鐵-鎳氫化酶廣泛存在于微生物種群中，而鐵-鐵氫化酶僅在一些厭氧細(xì)菌和厭氧真核微生物中被發(fā)現(xiàn)[86]，但是[Fe-Fe]氫化酶具有更高的產(chǎn)氫性能[87]。[Fe-Fe]氫化酶的活性中心由一個(gè)[4Fe-4S]簇和一個(gè)[2Fe-2S]簇組成。巴氏梭菌體內(nèi)的[Fe-Fe]氫化酶結(jié)構(gòu)如圖5所示，灰色區(qū)域包含一個(gè)H-團(tuán)簇，紫色區(qū)域包含[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇[88]。[Fe-S]在H-團(tuán)簇與外部電子載體之間的電子轉(zhuǎn)移中起到重要作用[89]。由于氫化酶的催化活性依賴于其活性位點(diǎn)上的金屬團(tuán)簇，因此加入金屬納米顆?？梢杂行У赜绊懓蛋l(fā)酵產(chǎn)氫的效率。金屬納米顆粒促進(jìn)暗發(fā)酵產(chǎn)氫主要通過以下幾個(gè)方面：一是消耗系統(tǒng)中的氧為厭氧菌提供厭氧環(huán)境[26, 90-91]；二是金屬納米顆粒的表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)可以提高微生物體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移速率；三是提高氫化酶和鐵氧還蛋白的活性。以Fe0NPs為例[91]（圖6），在進(jìn)入微生物體內(nèi)后，當(dāng)Fe0NPs在水相中暴露于氧氣時(shí)通過以下反應(yīng)被氧化[26, 92]：

圖5

圖5   氫化酶的活性部位結(jié)構(gòu)[26, 88]

Fig.5   Chemical structure of the active site for hydrogenase[26, 88]

2Fe0+O2+2H2O2Fe2++4OH-, ΔE0=1.67 V(5)

圖6

圖6   納米零價(jià)鐵金屬顆粒在暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程中的作用機(jī)理[91]

Fig.6   Mechanism of Fe0 NPs in dark fermentative hydrogen from lignocellulose[91]

這一反應(yīng)可在不到1min內(nèi)完成。消耗掉可用的氧氣后，由于水的氧化還原電位比氧氣低，F(xiàn)e0NPs被水氧化，然后生成氫氣作為反應(yīng)的唯一產(chǎn)物：

Fe0+2H2OFe2++2OH- + H2(6)

由于Fe0/Fe2+的氧化還原電位低，上述反應(yīng)在環(huán)境溫度和壓力下很容易發(fā)生。值得注意的是，鐵顆粒尺寸從微米級減小到納米級可以將上述反應(yīng)的速率提高10000倍[92-93]。反應(yīng)產(chǎn)生的Fe2+能夠提高氫化酶和鐵氧還蛋白的活性，因?yàn)殍F元素是它們活性位點(diǎn)上的關(guān)鍵元素[89]。

金屬納米顆粒通過提高氫化酶的活性促進(jìn)暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程已經(jīng)得到界內(nèi)的認(rèn)可，一些學(xué)者近年來利用鐵、鎳和其他金屬納米顆粒及其摻雜復(fù)合材料等來促進(jìn)暗發(fā)酵產(chǎn)氫的研究總結(jié)見表2。Han等[60]研究了不同濃度的Fe2O3NPs對以丁酸梭菌為優(yōu)勢菌群的混合厭氧細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)在以蔗糖為底物的間歇反應(yīng)器中介導(dǎo)的暗發(fā)酵生物制氫的影響，發(fā)現(xiàn)在最適溫度35℃，pH=8.48，納米顆粒的濃度為200 mg/L的條件下，最大產(chǎn)氫量達(dá)3.21 mol H2/(mol蔗糖)，比對照組（添加量為0）的產(chǎn)氫量高32.64%。不同金屬納米顆粒的復(fù)合材料也有相應(yīng)的研究，Beckers等[110]研究了包裹在多孔SiO2中的Fe x O y 、Pd、Ag、Cu復(fù)合納米顆粒（FeNPs@SiO2,PdNPs@SiO2，AgNPs@SiO2，CuNPs@SiO2）對暗發(fā)酵厭氧丁酸梭菌產(chǎn)氫的影響，發(fā)現(xiàn)與對照組（不添加納米顆粒）相比，復(fù)合納米顆粒均對產(chǎn)氫有促進(jìn)作用，其中FeNPs@SiO2納米顆粒的作用最明顯，氫氣總產(chǎn)量提高了38%，平均比產(chǎn)氫速率從44.7 ml/h提高到61.8 ml/h。

表2   不同類型金屬納米材料在暗發(fā)酵生物制氫中的應(yīng)用

Table 2  Application of different MNPs in dark fermentative hydrogen production

① 與不添加納米材料的對照組比較。

Gadhe等[107]研究了Fe2O3NPs添加量對產(chǎn)氫量和比產(chǎn)氫速率的影響，隨著添加量從0.5 mg/L提升到50 mg/L，產(chǎn)氫量提高了22%；當(dāng)添加量為50 mg/L時(shí)，產(chǎn)氫量較對照組（添加量為0）提高了24%，比產(chǎn)氫速率提高了43%；而當(dāng)添加量超過50 mg/L時(shí)，氫氣產(chǎn)量和比產(chǎn)氫速率均出現(xiàn)了下降，這可能是由于高濃度Fe2O3下氧化自由基增加引起的氧化應(yīng)激使氫化酶的功能結(jié)構(gòu)發(fā)生變形所導(dǎo)致的[38, 60, 114]。在暗發(fā)酵生物制氫中，投加過高濃度的金屬納米顆粒可能會導(dǎo)致氫氣產(chǎn)量下降，這一現(xiàn)象在很多研究中都有報(bào)道。圖7總結(jié)了一些研究中暗發(fā)酵氫氣產(chǎn)量與金屬納米顆粒投加濃度的關(guān)系，可以看出隨著投加量增加，氫氣產(chǎn)量均出現(xiàn)先增加后降低的趨勢。Zhang等[102]利用Fe2O3/carbonNPs促進(jìn)暗發(fā)酵生物制氫，發(fā)現(xiàn)納米顆粒濃度為200 mg/L時(shí)氫氣產(chǎn)量最高，當(dāng)濃度達(dá)到400 mg/L時(shí)，氫氣產(chǎn)量與對照組相比降低了5.5%，這可能是因?yàn)榧{米顆粒在濃度過高時(shí)會通過氧化應(yīng)激、細(xì)胞壁穿透和破損降低微生物的活性[36]。Rambabu等[103]發(fā)現(xiàn)當(dāng)Fe3O4NPs濃度大于150 mg/L時(shí)，氫氣產(chǎn)量開始下降，當(dāng)濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)，氫氣產(chǎn)量低于對照組。高濃度的金屬納米顆粒會增大其穿過微生物細(xì)胞的濃度梯度，導(dǎo)致金屬納米顆粒擴(kuò)散進(jìn)入微生物細(xì)胞。這些穿透進(jìn)入細(xì)胞的金屬納米顆粒會損害細(xì)胞器，不僅導(dǎo)致細(xì)胞中重要組分流失，還會對遺傳物質(zhì)造成損害[116]。納米顆粒濃度過高還會導(dǎo)致氫化酶中Fe-S亞基上的L-半胱氨酸配體上的硫原子形成不可逆鍵，這種結(jié)合會通過二硫酸代酸鹽橋聯(lián)的破壞而導(dǎo)致酶活性位點(diǎn)損壞[117]。因此，保證合適的金屬納米顆粒投加濃度對提高暗發(fā)酵氫氣產(chǎn)量尤為重要。

圖7

圖7   金屬納米顆粒濃度與木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵氫氣產(chǎn)量之間的關(guān)系[91, 95, 102-104, 115]

Fig.7   Relation between addition of MNPs and H2 production in dark fermentation from lignocellulose[91, 95, 102-104, 115]

Mullai等[108]研究鎳納米顆粒對暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響，發(fā)現(xiàn)在pH=5.6、溫度30~35℃時(shí)，產(chǎn)氫量可提高21%，且鎳納米顆粒濃度為5.67 mg/L時(shí)，在最佳條件下可獲得4400 ml的累積產(chǎn)氫量。Yang等[91]研究發(fā)現(xiàn)Fe0NPs可使產(chǎn)氫量和比產(chǎn)氫速率分別提高73.1%和128.3%，這是由于Fe0NPs加快了鐵氧還蛋白和氫化酶之間的電子轉(zhuǎn)移速率，從而增強(qiáng)了微生物的活性。Zhang等[30]比較了中溫（37℃）和高溫（55℃）下添加不同劑量的NiFe2O4NPs對微生物產(chǎn)氫的效果。37℃時(shí)添加量為100 mg/L和55℃時(shí)添加量為200 mg/L時(shí)，得到最高的H2產(chǎn)率分別為222 ml H2/(g葡糖糖)和130 ml H2/(g葡糖糖)，較對照組分別提高38.6%和28.3%。這是由于NiFe2O4NPs經(jīng)微生物的內(nèi)吞作用釋放的鐵和鎳有利于鐵氧還蛋白和氫化酶的合成，增強(qiáng)了丁酸鹽產(chǎn)氫途徑，優(yōu)化了微生物群落結(jié)構(gòu)，增加了丁酸梭菌的豐度。

3 金屬納米顆粒對木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵產(chǎn)氫微生物的影響

3.1 金屬納米顆粒對暗發(fā)酵生物制氫過程中微生物細(xì)胞的影響

金屬納米顆粒促進(jìn)暗發(fā)酵生物制氫還體現(xiàn)在其對微生物細(xì)胞的影響，研究關(guān)注主要包括微生物代謝途徑、電子傳遞、氫化酶活性、胞外聚合物以及細(xì)胞的形貌變化。

暗發(fā)酵產(chǎn)氫往往伴隨溶解性細(xì)胞代謝產(chǎn)物（SMPs）的生成，包括乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）及乙醇等。這些產(chǎn)物作為評價(jià)發(fā)酵性能的重要指標(biāo)，研究者通過分析產(chǎn)生的SMPs來反映添加金屬納米顆粒對微生物代謝途徑的影響。Cao等[118]研究了鐵鎳復(fù)合的堿基磁性納米顆粒（AMNPs）對混合培養(yǎng)細(xì)菌在中溫、高溫條件下的SMPs，發(fā)現(xiàn)AMNPs在中溫條件下能調(diào)控微生物的丁酸型發(fā)酵和乙酸型發(fā)酵途徑，使體系中NADH/NAD+達(dá)到平衡；而在高溫條件下，AMNPs可平衡微生物的乙酸型發(fā)酵和乙醇型發(fā)酵，且AMNSs的堿性能夠?qū)σ掖夹桶l(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸起到緩沖作用。Cheng等[119]發(fā)現(xiàn)添加Fe3O4NPs可使產(chǎn)氣腸桿菌（E. aerogenes ZJU1）暗發(fā)酵產(chǎn)氫的代謝途徑從丁酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜嵝桶l(fā)酵，這是由于乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸不消耗NADH，故增加了細(xì)胞內(nèi)NADH的積累并強(qiáng)化了NADH產(chǎn)氫途徑。Lin等[24]發(fā)現(xiàn)添加Fe2O3NPs使腸桿菌屬細(xì)胞的SMPs中乙醇含量減少、乙酸含量增加，這說明Fe2O3NPs改變了腸桿菌的代謝途徑，強(qiáng)化了乙酸型發(fā)酵的同時(shí)減弱了乙醇型發(fā)酵，從而提高了H2產(chǎn)量。

具有導(dǎo)電性的磁鐵礦或金屬鐵氧化物具有促進(jìn)種間電子傳遞（interspecies electron transfer, IET）的功能，IET又可分為介導(dǎo)型種間電子傳遞（MIET）和種間直接電子傳遞（DIET）[120]。在MIET機(jī)制中，電子通過可溶性介質(zhì)（如甲酸鹽、H2）傳遞[121-122]，而DIET是一種更為高效的種間電子傳遞方式，微生物細(xì)胞通過細(xì)胞膜表面的導(dǎo)體（如纖毛）進(jìn)行電子傳遞，不需要介質(zhì)的參與[123]。金屬納米顆?？赏ㄟ^聚集形成微生物細(xì)胞間的“非生物納米導(dǎo)線”，彌補(bǔ)如細(xì)胞色素C、纖毛等生物導(dǎo)體的不足，促進(jìn)種間直接電子傳遞和細(xì)胞膜內(nèi)電子傳遞（圖8）[120, 124-125]。Han等[60]通過透射電鏡觀察到了暗發(fā)酵制氫過程中Fe2O3NPs黏附在混合菌群細(xì)胞表面[圖9(a)]，這可能有助于細(xì)胞的固定，并增加其與基質(zhì)接觸的機(jī)會。此外，在暗發(fā)酵初期，混合菌群中的某些細(xì)菌可通過胞外呼吸的方式，將細(xì)胞內(nèi)氧化有機(jī)物產(chǎn)生的電子跨膜傳遞到胞外電子受體表面，而附著在細(xì)菌表面的Fe2O3NPs可作為胞外呼吸的末端電子受體。并且由于部分鐵氧化物具有良好的導(dǎo)電性，在胞外電子傳遞過程中可充當(dāng)導(dǎo)電材料。異化鐵還原菌是可進(jìn)行胞外呼吸的典型代表微生物，能以含三價(jià)鐵的鐵氧化物作為外源末端電子受體，將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵。Zhang等[30]在混合菌群暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程中投加NiFe2O4NPs，發(fā)現(xiàn)雖然NiFe2O4NPs中鐵元素多為三價(jià)鐵形式，但系統(tǒng)液相中鐵卻以Fe2+形式存在，這表明NiFe2O4NPs中的鐵可被異化鐵還原菌作為電子受體利用，梭菌作為一種典型的發(fā)酵型異化鐵還原菌在以葡萄糖為碳源的鐵還原環(huán)境中起主導(dǎo)作用。金屬納米顆粒作為介導(dǎo)電子供體菌與電子受體菌之間的“橋梁”在種間電子傳遞過程中發(fā)揮作用。Lin等[24]通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與未添加Fe2O3NPs的細(xì)胞相比，添加Fe2O3NPs的腸桿菌細(xì)胞表面出現(xiàn)更多的團(tuán)聚體，這些團(tuán)聚體是細(xì)胞表面蛋白與Fe2O3NPs響應(yīng)產(chǎn)生的生物納米導(dǎo)線（bacterial nanowire，BN）（圖10），能促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)也在細(xì)胞間的電子傳遞中起到重要作用。El-Naggar等[126]也證實(shí)了電子會沿著西瓦氏菌的生物納米導(dǎo)線傳遞。

圖8

圖8   金屬納米顆粒在產(chǎn)氫和產(chǎn)甲烷過程中參與微生物種間電子傳遞[120]

Fig.8   MNPs involve in intracellular and extracellular electron transportation for H2 and CH4 production via IET interaction[120]

圖9

圖9   透射電鏡下觀察到的聚集在細(xì)菌表面的金屬納米顆粒[60, 119]

Fig.9   TEM images of MNPs stuck to the bacterial surfaces[60, 119]

圖10

圖10   掃描電鏡下觀察到的腸桿菌細(xì)胞表面蛋白與Fe2O3NPs響應(yīng)產(chǎn)生的生物納米導(dǎo)線[24]

Fig.10   SEM images of bacterial nanowire produced by response of surface protein of E. aerogenes cells and Fe2O3NPs[24]

金屬納米顆粒在暗發(fā)酵過程中通過溶解或經(jīng)微生物侵蝕釋放出金屬離子，這些多價(jià)態(tài)金屬離子（如鐵離子）能夠與細(xì)胞膜表面的蛋白受體發(fā)生作用，促進(jìn)胞外電子轉(zhuǎn)移。細(xì)胞外溶解的金屬離子進(jìn)入微生物體內(nèi)能夠促進(jìn)胞內(nèi)電子傳遞。Lin等[24]還發(fā)現(xiàn)Fe2O3NPs能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在微生物代謝產(chǎn)生的VFAs的腐蝕下，逐漸釋放Fe2+。鐵作為重要的生命元素，參與微生物代謝活動(dòng)中關(guān)鍵酶或蛋白質(zhì)的組成（如氫化酶和鐵氧還蛋白），因此金屬納米顆粒中溶解釋放出的鐵離子能對氫化酶或鐵氧還蛋白的合成起到促進(jìn)作用。Cao等[118]發(fā)現(xiàn)適量的AMNPs添加可提高混合菌群氫化酶的活性，其中添加100 mg/L AMNPs的系統(tǒng)中微生物氫化酶活性比對照組高28%，這可能是由于AMNPs受到氫化酶的活性位點(diǎn)的侵蝕，釋放出了Fe2+并與細(xì)胞表面的氫化酶相互作用，促進(jìn)電子傳遞。Cheng等[119]發(fā)現(xiàn)Fe3O4NPs投加量為200 mg/L時(shí)，E.aerogenes ZJU1細(xì)胞的NADH/NAD+比值、氫化酶活性和細(xì)胞內(nèi)電子傳遞速率均得到提高。Fe3O4NPs聚集在E. aerogenes ZJU1細(xì)胞表面[圖9（b）]，與細(xì)胞膜上的氫化酶發(fā)生作用，加速氫化酶中的電子轉(zhuǎn)移。同時(shí)，F(xiàn)e3O4NPs釋放的Fe2+對氫化酶的合成及其活性的提高起到了促進(jìn)作用。此外，還認(rèn)為Fe3O4NPs的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和優(yōu)異的導(dǎo)電性能促進(jìn)了胞內(nèi)電子傳遞。由于氫化酶對氧化還原電位較為敏感，F(xiàn)e3O4NPs還能通過調(diào)控NADH的水平降低氧化還原電位，從而提高氫化酶活性。Han等[60]發(fā)現(xiàn)隨著暗發(fā)酵時(shí)間的延長，F(xiàn)e2O3NPs的尺寸從50 nm逐漸減小至10 nm，同時(shí)系統(tǒng)中鐵離子的濃度也不斷增加。鐵離子的緩慢釋放可避免其濃度過高導(dǎo)致細(xì)胞損害。投加200 mg/L的Fe2O3NPs后，細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)相較對照實(shí)驗(yàn)組變得更加細(xì)長。

Cao等[118]發(fā)現(xiàn)暗發(fā)酵后AMNPs中的鐵和鎳大量聚集在微生物細(xì)胞表面，除了與細(xì)胞膜上的蛋白、酶發(fā)生反應(yīng)，還能與胞外聚合物發(fā)生作用，使其中的酶釋放進(jìn)一步加速蛋白質(zhì)和多糖的水解。Zhang等[30]通過三維熒光發(fā)現(xiàn)添加NiFe2O4NPs后細(xì)菌產(chǎn)生的胞外聚合物中腐殖酸類有機(jī)物的含量有所增加，這類有機(jī)物中的羥基和羧基可與金屬離子螯合，增加金屬離子的生物可利用性和遷移性。Cheng等[119]也發(fā)現(xiàn)投加Fe3O4NPs后細(xì)菌胞外聚合物中腐殖酸和黃腐酸類物質(zhì)含量增加，這有利于細(xì)菌之間電子傳遞。胞外聚合物還能起到阻擋金屬納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的作用，防止納米顆粒過多地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞的損壞。Zhang等[30]觀察發(fā)現(xiàn)，盡管細(xì)菌形成的胞外聚合物能作為屏障將大部分NiFe2O4NPs阻擋在細(xì)胞外，但依然有少量NiFe2O4NPs能夠穿過細(xì)胞膜進(jìn)入微生物體內(nèi)并促進(jìn)胞內(nèi)電子傳遞。Zhao等[127]也通過實(shí)驗(yàn)證明一定量的CuONPs能夠在不破壞細(xì)胞膜的情況下進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞。

3.2 金屬納米顆粒對暗發(fā)酵生物制氫過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

能夠進(jìn)行暗發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物很多，主要包括：梭菌屬（Clostridium sp.）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio sp.）、埃希氏菌屬（Escherichia sp.）、丁酸芽孢桿菌屬（Trdiumbutyricum sp.）、檸檬酸細(xì)菌屬（Citrobacter sp.）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）、醋微菌屬（Acetomicrobium sp.）、甲烷球菌屬（Methanococcus sp.）等。在中溫和高溫條件下，梭菌是主要的產(chǎn)氫微生物，這使得梭菌成為暗發(fā)酵微生物群落中重點(diǎn)關(guān)注的對象[128-129]。研究者們經(jīng)常采用接種污泥的混合菌群來進(jìn)行暗發(fā)酵，這其中除了含有嚴(yán)格厭氧微生物外，還含有兼性厭氧菌（如腸桿菌）。兼性厭氧菌會消耗系統(tǒng)中的氧氣，減少氧氣對嚴(yán)格厭氧菌的限制，因此在暗發(fā)酵生物制氫中采用混合菌群可以獲得更好的協(xié)同產(chǎn)氫效果[87]。然而混合菌群中的乳酸菌等會同產(chǎn)氫細(xì)菌爭奪基質(zhì)，降低產(chǎn)氫效果[130]。投加金屬納米顆粒能夠改變暗發(fā)酵產(chǎn)氫系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)，使產(chǎn)氫細(xì)菌成為優(yōu)勢菌種，從而促進(jìn)氫氣產(chǎn)量的提高。

微生物群落結(jié)構(gòu)變化會對系統(tǒng)的產(chǎn)氫性能產(chǎn)生顯著影響。群感效應(yīng)（quorum sensing，QS）是微生物群體、個(gè)體之間通過分泌、釋放特定的信號分子來調(diào)控菌群的行為和功能，使其適應(yīng)環(huán)境變化的信號通訊基質(zhì)[131]。典型的QS信號分子有高絲氨酸內(nèi)酯（AHL）、寡肽類化合物。雖然生物制氫是一個(gè)涉及多菌群的發(fā)酵過程，但是目前有關(guān)QS在生物制氫過程中影響微生物協(xié)同作用的研究卻未有報(bào)道。微生物菌群為了能夠在共同生存的環(huán)境中存活，形成了一種對抗QS的機(jī)制，稱為群體猝滅效應(yīng)（quorum quenching，QQ），這是一種有效干擾群體感應(yīng)中關(guān)鍵過程、促使信號分子失效的過程[132]。在變形菌門、厚壁菌門和放線菌門中均存在QQ效應(yīng)。這些細(xì)菌可以分泌群體效應(yīng)猝滅酶（如AHL內(nèi)酰胺酶）降解AHL信號分子[132-133]。Kumar等[134]報(bào)道了芽孢桿菌具有產(chǎn)氫性能，并且能夠分泌AHL內(nèi)酰胺酶。此外，很多金屬離子和化學(xué)試劑會影響AHL內(nèi)酰胺酶的活性，一定濃度的Na+、K+、Ca2+、Fe3+、Mn2+對AHL內(nèi)酰胺酶的活性有正向作用[135-136]。金屬納米顆粒釋放的Fe3+或許能夠?qū)Π蛋l(fā)酵產(chǎn)氫過程中某些細(xì)菌的QQ起到促進(jìn)效果，也可能強(qiáng)化系統(tǒng)中微生物群體的QS影響產(chǎn)氫效果，然而目前還沒有相關(guān)的研究報(bào)道出現(xiàn)。

目前針對暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程中微生物群落變化的研究主要是通過高通量測序觀察微生物的相對豐度變化。Yang等[99]研究了鐵納米顆粒添加對暗發(fā)酵微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)相較于對照組，添加Fe0NPS、carbon/Fe0NPs樣品的Simpson指數(shù)顯著降低，Shannon指數(shù)顯著升高，表明這兩種添加劑顯著提高了系統(tǒng)中微生物的多樣性。此外，還可使腸桿菌屬（Enterobacter sp.）和梭菌屬（Clostridium sp.）的相對豐度存在顯著差異。對照組、Fe0NPS和carbon/Fe0NPs的實(shí)驗(yàn)組中Enterobacter sp.分別占87.8%、52.8%和15.6%，Clostridium sp.分別占7.2%、40.3%和77.5%。Zhang等[100]研究了零價(jià)鐵粉末-活性炭（ZVI-AC）強(qiáng)化生物制氫過程中微生物群落的變化，發(fā)現(xiàn)添加了ZVI-AC樣品的Shannon指數(shù)（4.701）大于對照組。較高的物種多樣性有利于維持微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化主要源于ZVI的添加。在添加ZVI-AC的系統(tǒng)中，梭菌屬（Clostridium sensu sticto）成為主要的微生物，比對照組高33%。在另一項(xiàng)研究中，Yang等[91]研究發(fā)現(xiàn)添加400 mg/L Fe0NPS的實(shí)驗(yàn)組中狹義梭菌屬（菌株Clostridium sensu stricto1與Clostridium sensu stricto3）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）分別占66.5%、20%，而對照組狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto1）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）和微桿菌屬（Exiguobacterium sp.）分別占11.9%、64.4%和22.5%。微生物群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化很可能是由于Fe0NPS使系統(tǒng)中的氧化還原電位降低，有利于嚴(yán)格厭氧菌的生長。在氫氣發(fā)酵過程中，氧化還原電位是影響系統(tǒng)產(chǎn)氫性能的關(guān)鍵因素[137]。嚴(yán)格厭氧菌在氧化還原電位低于-200 mV的環(huán)境下表現(xiàn)出較好的活性，而向系統(tǒng)中添加了400 mg/L Fe0NPS后，系統(tǒng)的氧化還原電位從-133.6 mV降低至-273.3 mV，使優(yōu)勢菌屬從腸桿菌屬變?yōu)樗缶鷮?。雖然腸桿菌屬和梭菌屬都能利用多種底物（如葡萄糖、蔗糖、半纖維素和纖維素）產(chǎn)氫，但梭菌屬的產(chǎn)氫能力高于腸桿菌屬，這是因?yàn)槟c桿菌屬只能通過甲酸分解途徑產(chǎn)氫[理論產(chǎn)氫量為2 mol H2/(mol葡萄糖)]，而梭菌屬可通過丙酮酸分解途徑和NADH途徑產(chǎn)氫[理論產(chǎn)氫量為4 mol H2/(mol葡萄糖)]。

向暗發(fā)酵生物制氫系統(tǒng)中添加金屬納米顆粒也可能導(dǎo)致微生物多樣性降低。Mostafa等[104]研究發(fā)現(xiàn)在暗發(fā)酵產(chǎn)氫系統(tǒng)中添加磁鐵礦/氧化石墨烯納米顆粒（MGONPs）可使樣品中微生物多樣性低于對照組，但梭菌屬（Clostridium sp.）成為了優(yōu)勢菌種。這種微生物多樣性的降低有利于產(chǎn)氫優(yōu)勢菌群的存活并提高產(chǎn)氫量，因?yàn)槟承┤樗峋鶾如腸球菌（Enterococcus）]會與產(chǎn)氫細(xì)菌競爭可用底物，還會產(chǎn)生過氧化氫多肽抗生素進(jìn)一步抑制產(chǎn)氫細(xì)菌的活性[99]。Zhang等[30]研究了NiFe2O4NPs在中溫（37℃）和高溫（55℃）條件下對嗜溫菌和嗜熱菌群落結(jié)構(gòu)的影響。在投加NiFe2O4NPs后，嗜溫菌和嗜熱菌的微生物多樣性均出現(xiàn)下降（Shannon指數(shù)分別下降了0.338和0.036），但厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度均增大。厚壁菌（Firmicutes）可以形成內(nèi)生孢子以抵抗和適應(yīng)惡劣的環(huán)境，而其他一些菌株在高溫環(huán)境中會休克并且難以恢復(fù)。擬桿菌門（Bacteroidetes）和綠彎菌門（Chloroflexi）可以將復(fù)雜的有機(jī)物（如纖維素、蛋白質(zhì)和果膠）轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)。Elreedy等[111]研究了高溫條件下鐵、鎳、鋅納米顆粒對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。在添加α-Fe2O3NPs (200 mg/L)、NiONPs (20 mg/L) 和 ZnONPs(10 mg/L)的系統(tǒng)中，嗜熱厭氧菌的相對豐度從對照組的9.0%分別下降至4.0%、4.0%和5.0%；然而其中梭菌屬（Clostridium sp.）的相對豐度從10%分別增加至16%、18%和19%，最終也使產(chǎn)氫量得到提高。

4 總結(jié)與展望

將木質(zhì)纖維素用作原料進(jìn)行暗發(fā)酵生物制氫，不僅實(shí)現(xiàn)了氫氣的生產(chǎn)，也對廢物進(jìn)行了利用，是極具潛力的生物制氫手段。但暗發(fā)酵本身存在效率低、氫氣產(chǎn)量低的問題，木質(zhì)纖維素中也含有大量難降解的木質(zhì)素和半纖維素，因此該技術(shù)面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。隨著暗發(fā)酵生物制氫技術(shù)的發(fā)展，金屬納米顆粒作為輔助因子在木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵產(chǎn)氫中已經(jīng)得到探索和發(fā)展，有望克服暗發(fā)酵技術(shù)的瓶頸。金屬納米顆粒在木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵生物制氫中的作用包括：①強(qiáng)化木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理；②對水解酶的固定化，提高酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，從而提高酶對木質(zhì)素和纖維素的水解；③提高氫化酶活性促進(jìn)暗發(fā)酵產(chǎn)氫；④調(diào)控微生物細(xì)胞代謝途徑和促進(jìn)細(xì)胞電子傳遞；⑤改善暗發(fā)酵產(chǎn)氫體系中微生物群落結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)多菌群的協(xié)同高效產(chǎn)氫。

金屬納米顆粒輔助木質(zhì)纖維素生物制氫依然存在很多待解決的問題，如：①金屬納米顆粒應(yīng)用于木質(zhì)纖維素暗發(fā)酵生物制氫的機(jī)理還未得到充分的解釋（如功能化金屬納米顆粒水解木質(zhì)纖維素的機(jī)理、金屬納米顆粒的投加是否會對暗發(fā)酵產(chǎn)氫體系中微生物的群感效應(yīng)和群體猝滅效應(yīng)產(chǎn)生影響）；②合適的金屬納米材料（金屬種類、粒徑大?。?、基質(zhì)類型、納米顆粒投加濃度和酶固定化的最佳固定條件還需要進(jìn)一步探索；③金屬納米顆粒的合成成本較高，如何降低其制備成本以及提高可重復(fù)利用性，使得納米顆粒能夠在工業(yè)化規(guī)模的生物制氫中得到應(yīng)用；④如何實(shí)現(xiàn)金屬納米顆粒的分離與回收；⑤納米顆粒的合成主要通過化學(xué)方法，容易對環(huán)境和人體造成危害。如何減少化學(xué)物質(zhì)的使用，以降低納米顆粒的毒性。

面對這些問題，一些有潛力的發(fā)展方向也值得被越來越多的研究者探索，如：①金屬納米顆粒的綠色合成。使用植物提取物、廢棄物和微生物合成高穩(wěn)定性的納米材料，可減少化學(xué)試劑的使用并降低制備成本。②暗發(fā)酵的副產(chǎn)物（如揮發(fā)性脂肪酸）可用作光發(fā)酵生物制氫的底物，因此可將金屬納米顆粒應(yīng)用于暗發(fā)酵與光發(fā)酵的聯(lián)合生物制氫。