抑制性消減雜交技術(shù)在水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物中的應(yīng)用

    自20年前，由于分子生物的迅猛發(fā)展與物種基因組全序列測定計(jì)劃的逐漸結(jié)束，分子生物學(xué)的研究重心已轉(zhuǎn)向表達(dá)調(diào)控功能與基因功能研究。抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是一種鑒定、分離、篩選組織細(xì)胞中未知基因表達(dá)的新技術(shù)，它與抑制PCR與消減雜交相結(jié)合，具有靈敏度高、操作簡便、假陽率低于特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被學(xué)界視為應(yīng)用前景最看好的一種分子生物學(xué)研究方法。

一、抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)的原理

    抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是在抑制性PCR的基礎(chǔ)上，結(jié)合消減雜交步驟與均等化檢驗(yàn)子DNA單鏈步驟，簡單快捷地分離差異基因的方法，即富集差異序列，消減同源序列。

    這一方法根據(jù)雜交二級動(dòng)力學(xué)，使分子間原有單鏈DNA的豐度差異消失、DNA相對含量趨同。抑制性PCR指根據(jù)鏈間退火弱于鏈內(nèi)退火并且鏈內(nèi)退火更為穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)特性，非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列退火時(shí)分離出鍋柄形態(tài)的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，使其不能與引物配對與作為模板，從而選擇性地使得非目的基因片段難以擴(kuò)增。而在均等基因群的標(biāo)準(zhǔn)化步驟中，消減雜交能起到去除驅(qū)趕基因群和目的基因群之間的共有基因序列的作用，以正常擴(kuò)增基因的不同序列。

二、抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 優(yōu)點(diǎn)：在鑒定、分離、篩選與克隆差異表達(dá)的基因序列片段中，這種方法更適用于差異表達(dá)的新基因的發(fā)現(xiàn)；這種方法一般情況下4天左右就能得到差異表達(dá)基因片段的cDNA，其篩選周期比較低；一次抑制性消減雜交反應(yīng)就能夠分離上百個(gè)差異表達(dá)基因，效率非常高；這一技術(shù)成熟、簡單、易操作掌握。

2.2 缺點(diǎn)：這一技術(shù)對材料的要求高，所采用的材料背景差異不能過大；消減文庫中cDNA不能被酶完全消化，全長的cDNA無法通過此技術(shù)獲取，因此cDNA非全長；對模板需求量高，mRNA不符合要求量則很有可能將導(dǎo)致低豐度的cDNA難以被檢測出來。

三、抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)在水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物中的應(yīng)用

3.1 對發(fā)育與生殖相關(guān)基因的研究

    由于受到不同基因組的調(diào)控，無脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的各個(gè)階段都會(huì)產(chǎn)生分化出不同的器官與組織，該技術(shù)能對這些基因進(jìn)行鑒定與分離。在研究相關(guān)基因調(diào)控蝦的卵子發(fā)生過程時(shí)，有國外生物學(xué)家使用此技術(shù)建立了日本囊對蝦卵巢的DNA庫，發(fā)現(xiàn)在核糖體蛋白的精子或卵巢的基因表達(dá)量上有著不小的差異[1]。經(jīng)過分析得出，相對與肝臟、胰腺、睪丸、眼肌，卵巢中的核糖體蛋白含量要大得多。我國研究者陳金平使用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)建立了銀鯽心跳起始期與尾芽期的特異性質(zhì)庫，篩選這兩個(gè)階段的特異性基因，與中科院生物研究中心數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，得出心跳起始期絕大部分為已知基因，而232個(gè)尾芽期的雜交克隆中有155個(gè)可能是未知基因。這在很大程度上為分子生物學(xué)的分機(jī)機(jī)理研究做出了貢獻(xiàn)。

3.2 差異表達(dá)基因的篩選

    在水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖中，其環(huán)境往往受到溶解氧、鹽度與水溫的影響。美國生物學(xué)家Mercury等對太平洋牡蠣進(jìn)行試驗(yàn)，研究在缺氧的條件下太平洋牡蠣的反應(yīng)；日本生物學(xué)家福川對使用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)對草蝦基因表達(dá)情況的影響進(jìn)行研究，這種技術(shù)在低滲、低氧和高溫的情況下研究草蝦血細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座子和免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況也被廣泛應(yīng)用[2]。

    此外，還可通過抑制性消減雜交(SSH)文庫的建立，對水產(chǎn)動(dòng)物在污染水環(huán)境狀況下機(jī)能的適應(yīng)程度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，從而有利于基因差異表達(dá)的發(fā)現(xiàn)及篩選出相應(yīng)基因。瑞典科學(xué)家Manse在2009年研究了后期扇貝幼蟲遭到銅離子的脅迫后的基因差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了89個(gè)cDNA，其中57個(gè)可能為未知功能，32個(gè)為已知功能[3]。

四、結(jié)論

    抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是一種鑒定、分離、篩選組織細(xì)胞中未知基因表達(dá)的新技術(shù)，是在抑制性PCR的基礎(chǔ)上，結(jié)合消減雜交步驟與均等化檢驗(yàn)子DNA單鏈步驟，簡單快捷地分離差異基因的方法。

    抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)能對無脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的各個(gè)階段中產(chǎn)生分化出的不同的器官與組織的基因進(jìn)行分離與鑒定。同時(shí)，這種技術(shù)對水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境在受到溶解氧、鹽度與水溫的脅迫時(shí)，也能篩選出水產(chǎn)養(yǎng)殖生物差異表達(dá)的生理功能相關(guān)基因。此外，水產(chǎn)動(dòng)物在水污染環(huán)境下的生理功能適應(yīng)程度也可以對比抑制性消減雜交(SSH)庫進(jìn)行研究，從而篩選出差異表達(dá)基因。

【參考文獻(xiàn)】

[1]李小慶，景志忠. 抑制性消減雜交技術(shù)的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009（05）158—162.

[2]單曉楓，孫佳敏，張洪波等. 抑制性消減雜交技術(shù)及其在水生動(dòng)物基因克隆中的應(yīng)用[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010（09）：243—249.

[3]楊倩，成軍，劉妍等. 抑制性消減雜交技術(shù)原理及應(yīng)用[J].世界華人消化雜志，2008（11）：376—280.